Komplexes Messprinzip
XTRA-ARTIKEL AUSGABE 1/2018
Verfügbar auf der XN-Serie ist der WPC-Kanal eine optionale Applikation zur erweiterten WBC-Diagnostik. Das Messprinzip ist durchaus vielschichtig. In welchen Fällen ergeben sich nützliche Zusatzinformationen – und wie kommen sie zustande?
Dr. Georg Slavka aus Wien berichtet über seine Erfahrungen
Text: Dr. Georg Slavka
WPC steht für „white precursor and pathological cells“. Wie beim früheren IMI-Kanal werden Leukozyten mittels eines speziellen Lysereagenzes permeabilisiert und mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt. Beim WPC-Lysereagenz handelt es sich um ein Surfactant, eine Verbindung mit einem lipophilen (hydrophoben; non-polaren) und einem hydrophilen (polaren) Strukturanteil, das in Abhängigkeit vom Lipidgehalt der Zellmembran in dieser unterschiedlich große Poren ausbildet (Abb. 1 u. 2). Der Anteil an Cholesterin könnte hierbei eine Rolle spielen. Während Zellmembranen reifer Zellen einen relativ hohen Cholesteringehalt haben, ist das Cholesterin-Phospholipid-Verhältnis unreifer Zellen signifikant niedriger. Auch ein weiteres Prinzip macht sich der WPC-Kanal geschickt zunutze: Zellen einiger B-Non-Hodgkin-Lymphome, beispielsweise CLL, werden durch das Lysereagenz scheinbar so sehr in Mitleidenschaft gezogen, dass diese während der Inkubation beinahe ihr gesamtes Zytoplasma verlieren. Übrig bleiben nurmehr ihre Kerne, gut erkennbar an der deutlich geringeren Signalintensität im Vorwärtsstreulicht (FSC). Wegen der daraus resultierenden maximalen Anfärbung der nunmehr nackten Kerne ergibt sich gegenüber gesunden Zellen ein sehr viel stärkeres Fluoreszenzsignal.
mit besonderem Augenmerk auf die Doppel-
Phospholipidschicht der Zellmembran
und Fluoreszenzintensität
Normale, reife Leukozyten weisen in ihren Zellmembranen ein annähernd gleich hohes Verhältnis von Cholesterin und Phospholipiden auf, weshalb diese dann bei der Messung auch etwa dieselbe Fluoreszenzintensität zeigen. Unreife Zellen (Stammzellen und Blasten) haben einen niedrigeren Cholesterinanteil innerhalb der Zellmembran. Die durch das Lysereagenz entstehenden Poren fallen entsprechend kleiner aus, und während der Färbephase erreicht folglich weniger Fluoreszenzfarbstoff den Kern.
Der WPC-Fluoreszenzfarbstoff färbt hauptsächlich nukleäre DNA im Gegensatz zum Fluoreszenzfarbstoff, der im WDF-Kanal zum Einsatz kommt. Dieser färbt vorwiegend die zytoplasmatische RNA. Innerhalb der Blastenlinien ergeben sich zudem weitere Unterschiede. Lymphatische Blasten haben gegenüber myeloischen Blasten einen noch niedrigeren Cholesterinanteil und werden deshalb noch schwächer angefärbt.
Aus diesen Erkenntnissen ergibt sich die typische Aufteilung der erwähnten Zellpopulationen in der WPC-Grafik (Abb. 3). Im oberen Drittel finden wir reife Zellen, entsprechend ihrer Seitwärtsstreulichteigenschaften von links nach rechts Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten. Darüber kommen Zellen bestimmter B-Non-Hodgkin-Lymphome zu liegen, die eine geringere Toleranz gegenüber dem Lysereagenz aufweisen. Unterhalb der reifen Zellen finden wir unreife Vorstufen (Stammzellen und Blasten).
Klinische Fallbeispiele
Chronische lymphatische Leukämie
Zellen einer chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) fallen bereits im maschinellen Blutausstrich durch ihre ausgeprägte Fragilität auf (Gumprecht’sche Kernschatten). Die Zellmembran dieser Zellen scheint die geringste Toleranz gegenüber dem WPC-Lysereagenz aufzuweisen, was bei einigen Zellen offenbar die vollständige Auflösung des Zytoplasmas zur Folge hat. Erkennbar wird dies an dem sehr viel niedrigeren Vorwärtsstreulichtsignal dieser Zellen. Da in der Folge keine Barriere mehr besteht, werden die nackten Kerne mit dem Fluoreszenzfarbstoff maximal angefärbt.
Nicht alle malignen Zellen reagieren in diesem Ausmaß, weshalb die roten Punkte nicht die Gesamtheit der pathologischen Zellpopulation widerspiegeln. Die diagonale Auftrennung dieser Zellen in der WPC-Darstellung SSC/SFL (oft als Haifischflosse bezeichnet, Abb. 4) könnte einem zusätzlichen Phänomen zugrunde liegen, nämlich einer teilweisen Doublettenbildung, verursacht durch das Verkleben der angefärbten Kerne. Inwieweit auch Zellen anderer Lymphome diese geringe Toleranz gegenüber dem verwendeten Lysereagenz aufweisen, ist Gegenstand weiterer Untersuchungen.
Myelodysplastische Syndrome
Myelodysplastische Syndrome (MDS) fallen häufig durch die Befundkonstellation Panzytopenie, unterschiedlich ausgeprägte, jedoch meist geringe Blastenvermehrung und hypogranulierte, hyposegmentierte neutrophile Granulozyten auf. In den Darstellungen WBC und WPC fallen insbesondere die beiden letzten Eigenschaften durch entsprechende Veränderungen auf. Das Seitwärtsstreulichtsignal korreliert mit der Komplexität zellinterner Strukturen (Kernaufbau und Granularität).
Als Zeichen der Dysplasie finden wir beim MDS häufig Pseudo-Pelger-Formen (hypogranulierte, hyposegmentierte Granulozyten). Im WDF-Kanal erkennen wir bei den neutrophilen Granulozyten deshalb nicht selten eine signifikant verminderte Signalintensität im Seitwärtsstreulicht. Zusätzlich kommen im WPC-Kanal einige rot markierte Events zur Darstellung (Abb. 5). Diese weisen gegenüber reifen Zellen eine verminderte Signalintensität im Fluoreszenzkanal auf und sind deshalb als Ausdruck einer geringen Blastenvermehrung zu interpretieren.
Akute myeloische Leukämie
Myeloische Blasten weisen in ihrer Zellmembran einen geringeren Cholesterinanteil auf. Die Cholesterin-Phospholipid-Ratio ist deshalb vermindert1,2. Während der Inkubation mit dem WPC-Lysereagenz bilden sich zwar Poren in der Zellmembran der unreifen Zellen aus. Jedoch fallen diese kleiner aus als jene Poren, die bei reifen Zellen entstehen. Während der Färbephase gelangt deshalb eine geringere Farbstoffmenge in die Zellen, was zu einer geringeren Signalintensität im Fluoreszenzkanal führt. Entsprechend ihrer Seitwärtsstreulichteigenschaften stellen sich Blasten vorwiegend in der Lymphozyten-/Monozyten-Region dar. In der WPC-Darstellung erscheinen die Blasten deshalb entsprechend unterhalb dieser Zellen (Abb. 6).
Auch in Bezug auf ihre Größe kommen Blasten in der Vorwärtsstreulichtdarstellung in der Lymphozyten-/Monozyten-Region zur Darstellung. Diesem Umstand ist es zu verdanken, dass die verdächtigen Events rot abgebildet werden. Zellen mit geringem Seitwärtsstreulicht und stärkerem Vorwärtsstreulicht kommen teilweise innerhalb einer Region zu liegen, die als Blastengate bezeichnet wird. Die Anzahl der roten Punkte spiegelt deshalb auch hier nicht in vollem Umfang die Anzahl der malignen Zellen wider, da nicht in jedem Fall die gesamte Zellpopulation in das Blastengate fällt (Abb. 7).
Akute lymphatische Leukämie
Laut Literatur weisen unreife Vorstufen einer akuten lymphatischen Leukämie (ALL) den geringsten Cholesterinanteil auf. Das WPC-Lysereagenz bildet Poren aus, die in ihrer Größe noch geringer ausfallen als bei myeloischen Blasten, gut erkennbar an der noch geringeren Fluoreszenzintensität. Insbesondere bei Leukämien im Jugendalter könnten sich aus dieser Erkenntnis erste Hinweise auf die mögliche Blastenlinie der Blastenpopulation ergeben. Hinsichtlich der Verlässlichkeit dieser Differenzierung lässt sich aufgrund einer noch zu geringen Zahl an gemessenen ALL-Proben keine definitive Aussage treffen. Erste Ergebnisse korrelieren jedoch gut mit der zugrunde liegenden Technik und der Literatur.
Literatur
- 1 Eugene Gottfried et al. Lipids of human leukocytes: relation to cell type. Journal
of Lipid Research, Vol 8 (1967) - 2 John Klock et al. Cholesterol, phospho-lipids, and fatty acids of normal immature
neutrophils: comparison with acute myeloblastic leukemia cells and normal neutrophils.
Journal of Lipid Research, Vol 20 (1979)
Summary
- Der WPC-Kanal eignet sich zur Diagnose leukämischer Erkrankungen, indem Leukozyten permeabilisiert und mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt werden.
- Studien weisen darauf hin, dass Cholesterin eine wichtige Rolle in der Funktionsweise des Kanals spielt.#
Fotoquelle: Privat (G. Slavka)