Scientific Kalender September 2023
Identifizierung eines typischen CLL anhand zweier komplementärer Technologien
Wie können abnorme Lymphozyten mittels unterschiedlicher Techniken identifiziert werden?
anhand ihres RNA/DNA-Gehalts im WDF- und im WPC-Kanal eines Analysesystems der XN-Serie
durch Nachweis eines abnormen Lymphozyten-Phänotyps (Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie)
basierend auf morphologischen Merkmalen, wie einem hohen NC-Verhältnis, ovalen Zellkernen und heterogenem, verklumpten Chromatin im Zellkern
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Wissenschaftliche Hintergrundinformationen
Bei der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) handelt es sich um ein malignes Lymphom. Die WHO klassifiziert die CLL als eine reifzellige B-Zell-Neoplasie, an der hauptsächlich das periphere Blut und Knochenmark, aber auch Lymphknoten, Leber und Milz beteiligt sind [1]. Mit einer Inzidenz von 2–6 Fällen pro 100.000 Personen pro Jahr in der westlichen Welt ist die CLL die häufigste Leukämieform bei Erwachsenen [2] und, da sie mit einem relativ langen Überleben der Betroffenen einhergeht, der am weitesten verbreitete Typ [3,4].
Ein vorherrschend monomorphisches Erscheinungsbild der Lymphozyten deutet häufig auf eine klonale, neoplastische Zellpopulation hin. Eine typische CLL zeigt sich für gewöhnlich in Form von abnormen Lymphozyten; in diesem Fall als kleine, reif erscheinende Zellen mit geringer mitotischer Aktivität [1].
Mit Ausnahme der natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) kann die Linie der Lymphozyten nicht anhand einer Pappenheim-Färbung zuverlässig bestimmt werden. Die Lymphozyten können nur mittels Immunphänotypisierung zuverlässig bestimmt werden. Abnorme Lymphozyten einer CLL exprimieren die Oberflächenantigene CD19, CD20, CD5, CD23, CD43 und CD200 sowie entweder Kappa- oder Lambda-Leichtketten [5]. CD10 kann nicht nachgewiesen werden.
Hintergrundinformationen zum Fall
Ein Patient stellte sich aufgrund allgemeinen Unwohlseins beim Hausarzt vor. Es wurde eine periphere Blutprobe entnommen und an ein Labor geschickt. Die erste Analyse auf einem XN-20-Gerät zeigte eine normale PLT-Zahl und keine Anämie, dafür aber eine Lymphozytose mit potenziell malignen Zellen. Der Arzt schickte die Probe an das Durchflusszytometrie-Labor für eine Immunphänotypisierung. Die Probe wurde auf einem XF-1600-Analysesystem durchgemessen. Sie war positiv für CD19, CD5, CD20, CD23, Cd79b und zeigte eine monoklonale Proliferation der Lambda-Leichtkette.
Des Weiteren wurde ein Blutausstrich gemacht und auf dem automatisierten Digital-Imaging-Analysesystem DI-60 ausgewertet. Die Überprüfung des Ausstrichs ergab kleine Lymphozyten mit einem hohen Verhältnis von Nukleus zu Zytoplasma (kurz NC-Verhältnis) und ein Muster mit kondensiertem Chromatin im Zellkern. Sogenannte „Smudge“-Zellen konnten ebenfalls nachgewiesen werden. Diese werden typischerweise bei Patienten mit CLL beobachtet [6].
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Interpretation des Scattergramms und der Morphologie
Die Blutanalyse des Patienten ergab mit 26,17 x 103/µl eine deutlich erhöhte WBC-Zahl, von denen 80 % Lymphozyten waren (Lymph.zahl 21,15 x 103/µl). Dies zeigt sich im WDF-Scattergramm, wo die Lymphozytenpopulation als sehr dichte Wolke erscheint.
Die für den WPC-Kanal verwendeten Reagenzien wirken in Bezug auf die Membranen der WBC stärker lysierend als die Reagenzien für den WDF-Kanal, was zu einer höheren Permeabilität der Zellen führt. Die speziell für den WPC-Kanal verwendeten fluoreszierenden Marker markieren die DNA im Zellkern. Je größer die Permeabilität, desto mehr kann von dem fluoreszierenden Marker in die Zelle gelangen und an DNA binden, was zu einem stärkeren Fluoreszenzsignal führt. Neoplastische Zellen, die reifer sind, weisen aufgrund des hohen Lipidanteils in der Zellmembran eine höhere Permeabilität auf und geben daher ein starkes Fluoreszenzsignal ab. Dies ist im WPC-Scattergramm in Abbildung 1 zu sehen: Die Population der neoplastischen Lymphozyten bildet ein Cluster aus roten Punkten im stark fluoreszierenden Bereich des WPC-Scattergramms. Die SSC-FSC-Ansicht des WPC-Scattergramms zeigt zwei distinkte Lymphozytenpopulationen (blaue Kreise).
Die morphologische Analyse mit dem automatisierten Digital-Imaging-Analysesystem DI-60 zeigte das Vorliegen von Smudge-Zellen.
Interpretation der Ergebnisse der Immunphänotypisierung
Die Probe wurde vor der Färbung gewaschen, um nicht relevante Immunglobuline aus dem Plasma, die die Endergebnisse beeinflussen könnten, loszuwerden. Anschließend wurde das Protokoll für Lyse/Waschen abgearbeitet. Hier in aller Kürze:
- In ein Polystyren-Röhrchen (75 mm x 12 mm) wurde ein Antikörper-Cocktail gegeben.
- Es wurde ein 100-µl-Aliquot der gewaschenen Probe in das Röhrchen überführt. Der Inhalt des Röhrchens wurde mittels Vortexen (2.500 UPM für 5 Sekunden) gemischt.
- Anschließend wurde das Röhrchen im Dunklen bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubiert.
- Dann wurden 2 ml der 1 zu 10 verdünnten CyLyse-FX-Lösung in das Röhrchen gegeben. Dies lysiert die roten und fixiert die weißen Zellen. Der Inhalt des Röhrchens wurde mittels Vortexen (2.500 UPM für 5 Sekunden) gemischt.
- Anschließend wurde das Röhrchen im Dunklen bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert.
- Im nächsten Schritt wurde die Probe zweimal mit PBS gewaschen und abschließend im XF-1600-Analysesystem ausgewertet.
In der Probe und dem Cocktail-Gemisch kommt es zu Interaktionen zwischen Antikörpern und Antigenen: Die monoklonalen Antikörper binden an die spezifischen Zielantigene auf der Zelloberfläche. Jeder monoklonale Antikörper trägt ein fluoreszierendes Tag, das im Durchflusszytometer gemessen werden kann. So ist der Anwender in der Lage, zu unterscheiden, für was die Probe positiv und für was sie negativ ist. Auf dieser Basis gibt er dann das Ergebnis dieser Untersuchung weiter.
CyLyse FX ist eine auf Formaldhyd-basierende Lyselösung, die rote Zellen lysiert und weiße Zellen mit daran gebundenen getaggten Antikörpern fixiert. Ohne Lyse würde das Durchflusszytometer auch die für diesen Test nicht relevanten roten Zellen auswerten.
Abschließend wird die Probe zum Wegspülen der Trümmer der roten Zellen gewaschen. So erhält der Benutzer bei der automatisierten Auswertung der Probe ein eindeutiges Ergebnis. Zudem wird dadurch eine korrekte Datenanalyse sichergestellt.
In diesem Fall ergab die Immunphänotypisierung eine Lymphozytose und eine schwache, zweifach positive CD19/CD5-Population. Darüber hinaus wurde eine monoklonale Proliferation der Lambda-Leichtkette beobachtet. Für die Probe wurde zudem die Expression von CD20, CD23 und Cd79b nachgewiesen. Für CD10, CD11c und CD38 war die Probe negativ. All diese Beobachtungen weisen auf die Diagnose einer B-CLL hin.
Literatur
[1] WHO (2017): Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition, Volume 2
[2] Rozman C et al. (1995): Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 333(16): 1052-1057.
[3] Lanasa MC et al. (2010): Novel insights into the biology of CLL. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010:70-6.
[4] NIH National Cancer Institute (1975-2007): SEER Cancer Statistics Review.
[5] Rawstron AC et al. (2017): Reproducible diagnosis of chronic lymphocytic leukemia by flow cytometry: An European Research Initiative on CLL (ERIC) & European Society for Clinical Cell Analysis (ESCCA) Harmonisation project. Cytometry B Clin Cytom. 94(1): 121-128.
[6] Marionneaux SM et al. (2021): Smudge Cells in Chronic Lymphocytic Leukemia: Pathophysiology, Laboratory Considerations, and Clinical Significance. Lab Med. 52(5): 426-438.
White paper
The white blood cell differential (WDF) channel utilises fluorescence markers that can separate different WBC subtypes according to their cell membrane composition and cytoplasmic content
