Scientific Kalender Februar 2025
Diagnose der paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie
Welche Rolle spielt die Immunphänotypisierung in der PNH-Diagnostik?
Sie dient primär der Bestimmung des Hämoglobinspiegels im Blut während einer hämolytischen Krise.
Sie ermöglicht den Nachweis spezifischer Antikörper gegen Blutzellen bei Patienten mit PNH.
Man weist damit das Fehlen von Glykosylphosphatidylinositol(GPI)-verankerten Proteinen auf der Oberfläche von Blutzellen nach.
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Wissenschaftliche Hintergrundinformationen
Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie
Die paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) ist eine seltene und lebensbedrohliche klonale Störung der hämatopoetischen Stammzellen. Sie äußert sich in chronischer intravasaler Hämolyse durch das Komplementsystem, Thrombosen sowie Zytopenien infolge von Knochenmarkinsuffizienz. Ihre Ursache ist die klonale Expansion einer Mutation, die das Gen für PIG-A auf dem X-Chromosom deaktiviert und so zu einem Mangel an Glykosylphosphatidylinositol(GPI)-verankerten Proteinen auf der Zelloberfläche von Erythrozyten, Monozyten und Granulozyten führt. Zu diesen Proteinen zählen insbesondere die beiden komplementregulierenden Erythrozyten-Oberflächenproteine CD55 (Decay Accelerating Factor; DAF) und CD59 (Membrane Inhibitor of Reactive Lysis; MIRL) Der Mangel an diesen beiden Proteinen führt zur Zerstörung der betroffenen Erythrozyten in vivo [1].
Diagnose
Die Diagnosestellung bei PNH beruht auf einer Reihe von Laborbefunden:
- Durchflusszytometrischer Nachweis von Erythrozyten- und Leukozytenpopulationen, die negativ für GPI-verankertes Antigen sind
- Positiver Coombs-Test
- Anämie mit erhöhter Retikulozytenzahl
- Laktat-Dehydrogenase und Bilirubin erhöht
- Niedriger Haptoglobinwert
- Freies Hämoglobin im Serum und Hämoglobinurie
- Hämolyse- und/oder thromboseassoziierte Organschädigung [1]
Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung mit dem DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit
Die Durchflusszytometrie gilt als Goldstandard für den Nachweis von PNH-Klonen und spielt somit eine Schlüsselrolle für die Diagnostik, Überwachung und klinische Versorgung von Patienten mit PNH. Die neueste Fassung der Konsensleitlinie von ICCS und ESCCA [Zusammenfassung: 2] beschreibt den sensitiven und genauen Nachweis selbst kleiner PNH-Klone.
Das DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit wurde nach dieser aktuellen ICCS/ESCCA-Konsensleitlinie entwickelt und ermöglicht ein hohes Maß an Nachweisgenauigkeit, unter anderem durch die Aufnahme von FLAER (mit Alexa Fluor™ 488 markiertem Proaerolysin). FLAER bindet an den GPI-Anker und ermöglicht so, dessen (Nicht-)Vorhandensein auf Monozyten und neutrophilen Granulozyten unabhängig von einem einzelnen CD-Marker zu bestimmen.
Das Kit enthält zwei Röhrchen pro Patient:
- ein Erythrozyten-Röhrchen mit CD71, CD59 und CD235a
- ein Leukozyten-Röhrchen mit Proaerolysin, CD157, CD45, CD64, CD24, CD14 und CD15
Die Cocktails in beiden Röhrchen sind Trockenreagenzien; d. h. die Antikörper sind an der Röhrchenoberfläche angetrocknet. Das ermöglicht lange Haltbarkeit sowie Lagerung und Transport bei Raumtemperatur. Einzelheiten zur Probenvorbereitung, zum Gating und zur Interpretation sind der Gebrauchsanweisung zu entnehmen.
Fall und Ergebnisse
Eine 19-jährige afroamerikanische Frau kam mit Husten und dunkel verfärbtem Urin in eine Notaufnahme; ansonsten war sie bis dahin gesund. Die Familienanamnese ergab, dass bei der Schwester zuvor eine Sichelzellen-Erbanlage diagnostiziert worden war.
Hämatologische Ergebnisse
Eine Blutprobe wurde ins Hämatologielabor eingesandt, wo ein großes Blutbild mit einem Analysesystem der XN-Serie erstellt wurde. Die Ergebnisse (Abb. 1) zeigten das Vorliegen einer Anämie.
| Rerun | Order | Run | Test | Result | C | Unit |
| I | 2 | CBC Profile | ||||
| I | 2 | HGB | 90 | g/l | ||
| I | 2 | WBC | 2,56 | 10*9/l | ||
| I | 2 | PLT | 69 | & | 10*9/l | |
| I | 2 | RBC | 2,48 | 10*1… | ||
| I | 2 | HCT | 0,277 | l/l | ||
| I | 2 | MCV | 111,7 | fl | ||
| I | 2 | MCH | 36,3 | pg | ||
| I | 2 | MCHC | 325 | g/l | ||
| I | 2 | RDW-CV | 19,9 | % | ||
| RET Profile | ||||||
| R | 2 | RET# | 70,7 | 10*9/l | ||
| R | 2 | RET% | 2,9 | % | ||
| R | 2 | RET-He | 28,3 | pg | ||
| A | 2 | PLT-O | 69 | 10*3/… |
Abb. 1 Hämatologie-Laborergebnisse laut Analysesystem der XN-Serie
Hier die für den konkreten Fall relevanten Parameter und in Klammern die dazugehörigen einrichtungsinternen Referenzbereiche:
| 90 g/l | (115 – 155 g/l) |
| 2,48 x 1012/l | (3,9 – 5,6 x 1012/l) |
| 0,277 l/l | (0,36 – 0,48 l/l) |
| 2,9% | (0,5 – 1,5%) |
Ergebnisse weiterer Untersuchungen
Weitere Laboruntersuchungen bestätigten, dass es sich um eine Anämie autoimmun-hämolytischer Art handelte:
| 3170 U/l | (87–225 U/l) |
| 1,9 mg/dl | (0–1,2 mg/dl) |
| 1,6 mg/dl | (0,2–0,7 mg/dl) |
| positiv |
Ergebnisse der durchflusszytometrischen Immunphänotypisierung
Die Patientin ging zu einem Hämatologen, der Proben zur Testung auf PNH an ein Durchflusszytometrielabor einsandte. Dort erfolgte die Immunphänotypisierung mit dem DryFlowEx PNH High-Sensitivity Assay Kit. Die Auswertung der Daten ergab bei Erythrozyten und Leukozyten einen signifikanten PNH-Klon mit klarem Fehlen GPI-verankerter Antigene.
Die Ergebnisse, die für die Erythrozyten mit dem entsprechenden Röhrchen gemessen wurden, ergaben einen Typ-III-Klon mit 76,75 % und einen Typ-II-Klon mit 2,54 % (Abb. 2).
Die Ergebnisse, die für die Leukozyten mit dem entsprechenden Röhrchen gemessen wurden, ergaben einen neutrophile-Granulozyten-Klon zwischen 95 und 97 % und einen Monozyten-Klon mit 98 % (Abb. 4).
Anhand dieser Informationen konnte der Hämatologe feststellen, dass bei der Patientin sowohl homozygote (Typ III) als auch heterozygote (Typ II) Formen von PNH-Klonen vorlagen. Er verordnete ihr Eculizumab, ein Immuntherapeutikum, das an das Komplementprotein C5 bindet und die Aktivierung des Komplementsystems hemmt [3]. Diese Bindung verhindert den Abbau von Erythrozyten in der Blutbahn.
In den folgenden sechs Monaten stabilisierten sich die Hämoglobin- und Erythrozytenwerte der Patientin bis in den Normalbereich, und es kam zu keinen weiteren hämolytischen Episoden.
Literatur
[1] Cançado RD et al. (2021): Consensus statement for diagnosis and treatment of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Hematol Transfus Cell Ther; 43(3):341-348. doi: 10.1016/j.htct.2020.06.006.
[2] Illingworth AJ, Marinov I, Sutherland DR (2019): Sensitive and accurate identification of PNH clones based on ICCS/ESCCA PNH Consensus Guidelines-A summary. Int J Lab Hematol; 41 Suppl 1:73–81. doi: 10.1111/ijlh.13011. PMID: 31069981.
[3] McKeage K (2011): Eculizumab. Drugs; 71:2327–2345. https://doi.org/10.2165/11208300-000000000-00000
